Identificação rápida de microrganismos causadores de mastite por espectrometria de massas

Resumo

O objetivo deste estudo é avaliar o uso da técnica de espectrometria por ionização e dessorção a laser assistida por matriz - tempo-de-vôo (MALDI-TOF) para a identificação direta (sem cultivo in vitro) de bactérias presentes em amostras de leite. Serão realizados dois experimentos: 1) Serão utilizados 30 isolados de cada patógeno causador de mastite, sendo estes Staphylococcus aureus, estafilococos coagulase negativa, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae e Corynebacterium sp., identificados pelo método microbiológico padrão, e uma cepa ATCC de cada patógeno, exceto para o grupo estafilococos coagulase negativa, totalizando 185 isolados. Para determinar a concentração bacteriana necessária para a identificação por MALDI-TOF MS em amostras de leite, será feita contaminação experimental de leite estéril, para a obtenção de concentrações de 103 a 109 ufc/ml e posteriormente aplicar o protocolo de identificação direta pela metodologia MALDI-TOF MS. 2) Serão selecionados 3 rebanhos leiteiros da região de Pirassununga/SP, para a realização de três coletas de leite individual de todas as vacas em lactação de cada rebanho, as amostras de leite serão coletadas a partir de quartos mamários. As amostragens do Experimento 1 e 2 serão submetidos as análises: de cultura microbiológica padrão; análise por espectrometria de massas por meio de colônias bacterianas e diretamente do leite; e contagem bacteriana total (CBT). As amostras de leite serão submetidas a citometria de fluxo e ao protocolo de recuperação de bactérias causadoras de mastite, estas serão analisadas por MALDI-TOF MS utilizando um espectrômetro Autoflex III (Bruker Daltonics, Billerica, USA). Os espectros obtidos serão analisados pelo programa MALDI Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics) com as configurações padrão para obtenção da identificação bacteriana. Espera-se com a realização deste estudo, o desenvolvimento de um método rápido, sensível e de custo razoável para a identificação dos microrganismos causadores de mastite, em amostras de leite. O uso da metodologia permitirá a segregação dos animais infectados ou a indicação de tratamento da mastite de forma mais adequada em função do tipo de agente causador. (AU)