Investigação dos mecanismos moleculares envolvidos no bloqueio da transição G2- mitose induzido por FGF2 em células malignas dependentes de Ras

Resumo

O interesse do nosso laboratório reside na compreensão dos mecanismos reguladores do ciclo celular de eucariotos. Desarranjos em tais mecanismos podem condenar as células à morte ou, no extremo oposto, causar a transformação maligna, e por isso estão envolvidos na etiologia de canceres e outras doenças importantes. Em 2008, publicamos que o FGF2, um clássico fator de crescimento com diversas atividades pró-tumorais, tem efeito antiproliferativo seletivamente em células transformadas por Ras. Desde então buscamos entender este fenômeno, e descobrimos que o FGF2 impede as células de entrarem em mitose. O tratamento nas primeiras quatro horas do ciclo de divisão é suficiente para bloquear as células em G2 e, caso o tratamento seja mantido de forma sustentada, observamos morte apoptótica 48 horas após a adição do FGF2 ao meio de cultura. A descoberta da inibição da transição G2-mitose é recente, e apesar dos avanços realizados, ainda não compreendemos este bloqueio molecularmente. Além disso, foram selecionadas em nosso laboratório sub-linhagens resistentes a este efeito tóxico do FGF2. Estas células conseguiram superar o bloqueio do início da divisão, e dados de minha iniciação científica apontam que esta superação e o surgimento do fenótipo resistente dependem da eliminação de um dos cromossomos marcadores da linhagem que usamos, que carrega aproximadamente metade das cópias amplificadas de k-Ras. A outra metade das cópias é carregada pelo segundo cromossomo marcador, e dados preliminares indicam que a sua eliminação nas linhagens resistentes não ocorreu possivelmente devido ao fato de este cromossomo ser o único cromossomo destas células que possui genes ribossomais ativos. O objetivo deste projeto é entender como o tratamento com FGF2 desarranja funcionalmente as proteínas que controlam o início da mitose e deixa as células bloqueadas em G2. Para isso, investigaremos o estado de ativação de proteínas chave que controlam essa transição por western blot e, paralelamente, estabeleceremos um protocolo de fosfoproteômica quantitativa para termos uma visão global deste desarranjo nas células tratadas com FGF2. Além disso, utilizaremos técnicas convencionais de citogenética, como bandamentos e hibridização in situ, para caracterizar as mudanças cariotípicas envolvidas na superação do bloqueio induzido pelo FGF2 e surgimento do fenótipo resistente. Essas abordagens nos permitirão identificar as proteínas alvo do FGF2 que são responsáveis pelo seu efeito tóxico, caracterizando molecularmente uma nova e inesperada função deste fator de crescimento. (AU)