Análise em larga-escala da função dos microRNAs no ciclo celular, pluripotência, auto-renovação e diferenciação de células-tronco utilizando High Content Screening

Resumo

Pluripotência e auto-renovação são propriedades específicas de células-tronco embrionárias (CTE). microRNAs (miRs) desempenham papéis importantes no controle pós-transcricional da expressão genica, pela regulação de múltiplos RNAm, e têm sido implicados na manutenção de características de células pluripotentes. Muitos efeitos dos miRs são atribuídos à regulação do ciclo celular, em linha com a ligação íntima entre a regulação do ciclo celular, auto-renovação, pluripotência e diferenciação. Iremos investigar sistematicamente os papéis de todos os miRs humanos atualmente anotados (2588 miRs maduros) nestas características, utilizando microscopia de fluorescência automatizada (High Content Screening). Imagens derivadas de células pluripotentes transfectadas com moléculas sintéticas miméticas de microRNAs, serão analisadas, a fim de quantificar características biológicas refletindo o status do ciclo celular (com base na coloração de Ciclina B1 e Hoechst / Conteúdo de DNA), pluripotência (com base na coloração de Oct4) e diferenciação (morfologia celular). Dados de cada célula serão combinados em perfis populacionais multiparamétricos descrevendo o fenótipo induzido pelos diferentes miR avaliados. Os perfis multiparametricos serão submetidos a análises de clusterização, para identificar grupos de microRNA com efeitos fenotípicos compartilhados. Finalmente, os alvos preditos dos miRs dos grupos identificados, serão submetidos a análises de enriquecimento funcional visando a identificação dos processos e vias de sinalização envolvidos nos fenótipos observados. O principal objetivo do presente pedido de bolsa FAPESP-BPE é permitir que o requerente desenvolva protocolos específicos para a análise das imagens e dos dados quantitativos, sob a orientação do Dr. Marc Bickle (Instituto Max Planck de Biologia Celular Molecular e Genética, Dresden-Alemanha). Para isto, imagens de um screen funcional piloto (focado em 30 miRs) serão utilizadas no desenvolvimento e otimização dos protocolos de análise. Uma vez estabelecidos, estes protocolos serão adaptados para o screen completo da biblioteca de miRs, que será realizado pelo estudante de doutorado Ildercílio Lima (supervisionado pelo Dr. Panepucci, FAPESP 2013/27061-0), em colaboração com o Dr. Miguel Mano (ICGEB, Trieste -Itália). Tendo em vista a complexidade das abordagens analíticas, esta colaboração vai trazer benefícios importantes, imediatos e precisamente definidos para o sucesso deste projeto (um sub-projeto do Centro de Terapia Celular - CTC, um CEPID FAPESP).