Estudos de cinética transiente de novas descarboxilases utilizando a técnica de absorção espectroscópica de stopped-flow

Resumo

Após a descoberta da enzima P450 descarboxilase OleTJE em 2011, com a propriedade única de descarboxilar ácidos graxos usando peróxido de hidrogênio como cofator e formando alcenos terminais como produto principal, o interesse científico e tecnológico nesta família de enzimas aumentou. Sabe-se que os alcenos possuem grande apelo econômico, principalmente na área de biocombustíveis, pois possuem propriedades químicas e físicas semelhantes aos combustíveis fósseis convencionais, com ausência de oxigênio em sua composição. Considerando que as peroxigenases possuem potencial atividade de descarboxilação e hidroxilação de ácidos graxos, a elucidação da intrigante mecanística envolvida na descarboxilação preferencial de OleTJE ainda é um desafio. Desta forma, a elucidação de novas estruturas da descarboxilase e estudos cinéticos de compostos intermediários (Composto I e Composto II) envolvidos no ciclo catalítico consistem em informações relevantes para melhor compreender a funcionalidade e os mecanismos reacionais dessas enzimas. Até o presente momento, a OleTJE é a única descarboxilase com parâmetros cinéticos do Composto I e Composto II, avaliados pela técnica de stopped-flow, disponível na literatura. O grupo de pesquisa da Dra. Zanphorlin do LNBR/CNPEM descobriu recentemente uma nova descarboxilase (OleTRN, patente número BR 10 2020 016004 4), que possui baixa similaridade de sequência com a OleTJE. Esta nova descarboxilase será aplicada no processo de produção de alcenos, proposto no projeto de pós-doutorado. Neste projeto, os alcenos serão produzidos por um processo de duas etapas: hidrólise dos óleos vegetais seguida da descarboxilação dos ácidos graxos. Para este fim, a OleTRN foi caracterizada e sua estrutura foi elucidada. Adicionalmente, mutações estruturalmente guiadas foram propostas, visando um melhor entendimento do mecanismo da enzima e a obtenção de maiores atividades catalíticas. Observou-se que algumas mutações apresentaram especificidade e quimiosseletividade diferentes ao variar o comprimento da cadeia dos substratos, o que é extremamente interessante do ponto de vista biotecnológico, uma vez que estas mutações poderiam diversificar a aplicabilidade da enzima. Neste contexto, o presente projeto de pesquisa no exterior propõe estudos cinéticos transientes da OleTRN e seus mutantes, e de novas descarboxilases UndA, utilizando a técnica de stopped-flow, disponível no laboratório do Dr. Makris, na North Carolina State University. Caracterizações bioquímicas aprofundadas podem ser extremamente relevantes para um melhor entendimento do ciclo catalítico de descarboxilases e será de extrema importância para a seleção do mutante mais ativo para aplicação na rota de produção de alcenos proposta no projeto de pós-doutorado. Assim, o projeto promoveria contribuições não só em termos de aplicação, mas também em termos de pesquisa fundamental. (AU)