Influência da remodelagem da parede celular e da membrana citoplasmática de Streptococcus mutans na interação dos componentes da matriz extracelular e da estrutura do biofilme

Resumo

A cárie resulta da disbiose desencadeada pelo metabolismo de carboidratos da dieta por microrganismos no biofilme dental. Os carboidratos são utilizados para a produção de componentes da matriz extracelular e ácidos orgânicos, que ficam retidos dentro do biofilme, e, com o tempo, desmineralizam as superfícies causando a perda de estruturas dentárias. Os principais componentes da matriz são exopolissacarídeos insolúveis e solúveis, DNA e ácidos lipoteicóicos extracelulares. A associação deles restringe a difusão de substâncias para dentro e fora do biofilme. O objetivo principal será determinar como a remodelagem da parede celular e da membrana citoplasmática de Streptococcus mutans (espécie modelo produtora de matriz) afeta a interconexão dos componentes da matriz e a sua configuração (criação de micronichos). Os objetivos complementares serão: investigar se existe uma associação entre GtfB funcional (síntese de glucanos insolúveis) e DltB (canal na membrana citoplasmática para a secreção de ácido lipoteicóicos ou LTA) na construção de biofilmes; e avaliar a alteração na carga da superfície celular (hidrofobicidade) resultante da deleção de genes. Portanto, a cepa UA159 e as cepas com deleção de genes específicos (lytS, lytT, dltA, dltD e ”gtfB) serão cultivadas em culturas planctônicas e as células serão coletadas em duas fases de crescimento (meio da exponencial e estacionária) para análise por microscopia de transmissão (MET) e eletrônica de varredura (MEV), de composição de ácidos graxos (FAME), análise química de LTA e carga. Em seguida, biofilmes das cepas UA159, dltD e ”gtfB serão formados sobre discos de hidroxiapatita com película salivar. Em idades de crescimento distintas, os biofilmes serão removidos em para análises de microscopia confocal (estrutura e criação de micronichos), FAME, químicas de LTA e transcriptoma (RNA-seq). Ainda, as microvesículas das membranas serão avaliadas para determinar a contribuição delas para a produção de exopolissacarídeos e eDNA. Para investigar se existe uma associação funcional entre GtfB e DltB, um mutante condicional para a expressão de ambos os genes será avaliado. Em adição, o mecanismo pelo qual LTA é sintetizado foi descrito para algumas espécies, mas não para S. mutans. Análise de homologia demostraram que o gene SMU_775c é um candidato para sintase de LTA. A deleção deste gene foi letal, então, um mutante condicional será construído e submetido a condições distintas de crescimento e ensaios para verificar o seu fenótipo. Os dados quantitativos serão analisados via estatística descritiva e inferencial (±=0,05). (AU)