Separação de fase líquido-líquido na formacão de microreatores enzimáticos

Resumo

Separação de fase líquido-líquido (do inglês liquid-liquid phase separation - LLPS) é um fenômeno bastante conhecido e usado em áreas como físico-química de polímeros, ciências e engenharia de materiais. Na LLPS, uma separação de fase termodinamicamente favorável dá origem a gotas líquidas ricas em um soluto (fase densa) que ficam dispersas em uma fase líquida diluída. Em Biologia Celular, LLPS recebeu recente atenção ao se demonstrar sua existência e relevância para compartimentalização do espaço intracelular. Em uma derivação dos achados celulares, LLPS envolvendo moléculas biológicas como proteínas e ácidos nucleicos tem sido explorada em aplicações biotecnológicas como drug delivery, biosensores e produção de microreatores. A presente proposta se encaixa nesta última aplicação e consiste na produção de proteínas quimera contendo uma proteína globular com potencial interesse biotecnológico (e que não seria capaz de sofrer LLPS) conjugada a domínios de baixa complexidade (LCDs). Nesta situação, os LCDs são usados como adesivos moleculares ao promover a LLPS da proteína quimera, assim originando um condensado biomolecular rico na proteína de interesse. Essa técnica pode ser utilizada em uma quantidade grande de aplicações, como no tratamento de águas, engenharia de tecidos, desenvolvimento de vacinas, biossensores, engenharia de alimentos, dentre outros. Neste projeto, a enzima citocromo P450 é a proteína de interesse. Sua participação em numerosos processos biológicos, como a produção de antibióticos, no metabolismo de drogas em células de mamíferos e desintoxicação de xenobióticos justifica o referido interesse. A P450 será conjugada a sequências de LCDs já conhecidos na literatura. Uma vez feito isto, será realizada a caracterização do condensado em termos de suas propriedades físico-químicas e atividade enzimática. Para caracterizar as fases separadas formadas, haverá análises estruturais da proteína quimera formada, através de calorimetria diferencial de varredura (DSC), dicroísmo circular (CD) e fluorescência. Para a observação das fases, as técnicas de microscopia e de espalhamento dinâmico de luz (DLS) serão utilizadas. Esperamos ser capazes de consolidar o método em nosso grupo de pesquisa através da produção da quimera P450-LCD, assim estendendo nossa expertise no tema e abrindo espaço para novas aplicações.