Reprogramação metabólica orgão-específica e comunicação baseada em vesículas extracelulares em macrófagos residentes

Resumo

Os macrófagos residentes são células imunológicas sentinela que detectam os micróbios e o microambiente tecidual, sendo essenciais para a defesa do hospedeiro. Eles são altamente heterogêneos, com cada subpopulação desempenhando papéis específicos de tecidos. No entanto, os mecanismos celulares subjacentes a essa heterogeneidade não são compreendidos, nem os mecanismos pelos quais os macrófagos de órgãos distintos comunicam entre si. Aqui, propomos investigar diferenças mecanísticas nas respostas provocadas por produtos microbianos em macrófagos que residem em diferentes órgãos, e a relevância potencial dessas diferenças para a comunicação entre órgãos. A reprogramação metabólica e sua relação com as vesículas da membrana extracelular (EVs) serão investigadas sob três objetivos específicos. Objetivo específico 1 (reprogramação metabólica): Durante a transição para um fenótipo promotor de inflamação, os macrófagos mudam o metabolismo energético da fosforilação oxidativa para glicólise aeróbica de alta taxa, com uma "quebra" do ciclo de Krebs. Isto resulta na acumulação de certos intermediários do ciclo de Krebs, tais como succinato, citrato, isocitrato e itaconato. Propomos que macrófagos que residem em diferentes órgãos exibirão perfis (proporções) metabólicos distintos, tanto intracelularmente quanto extracelularmente, durante a ativação por produtos microbianos. Esta noção será testada em macrófagos coletados do baço, fígado, pulmões e cérebro de camundongos machos C57/BL virgens. Os macrófagos de cada órgão serão estimulados com lipopolissacarídeo (LPS), poli(I:C) ou CpG oligodesoxinucleotídeo, e intermediários do ciclo de Krebs tanto de macrófagos (intracelulares) quanto de meios de cultura celular (extracelulares) serão avaliados por LC-MS/MS-baseada metabolômica. Os perfis metabólicos serão analisados em relação aos perfis de citocinas, avaliados por sequenciamento de RNA de última geração (RNAseq). Objetivo específico 2 (reprogramação metabólica ’ EVs): Propomos que a reprogramação metabólica dos macrófagos órgão-específicos estará ligada não apenas a perfis específicos de expressão de citocinas, mas também a perfis específicos de liberação de EVs. Macrófagos do baço, fígado, pulmões e cérebro serão coletados e estimulados como no Objetivo Específico 1. O tamanho e a quantidade de EVs no meio de cultura serão determinados por análise de detecção de pulso resistiva ajustável, análise de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão. O perfil do conteúdo das EVs será analisado por abordagens proteômicas e lipídicas não direcionadas. Objetivo Específico 3 (EVs ’ reprogramação metabólica): Aqui, iremos investigar o potencial das EVs para a comunicação inter-orgãos entre subpopulações de macrófagos. EVs liberadas por macrófagos estimulados por LPS de um órgão serão purificados e adicionados à cultura de macrófagos de um órgão diferente antes de sua estimulação. Como ponto de partida, e com base no nosso estudo anterior envolvendo esplenectomia, isso será feito através da incubação das EVs liberadas por macrófagos esplênicos com macrófagos coletados do fígado, pulmões e cérebro. A reprogramação metabólica e os perfis de citocinas serão avaliados como no Objetivo Específico 1. Este projeto de prova de conceito pode fornecer uma nova abordagem para investigar doenças infecciosas de uma perspectiva integrativa e orientada para sistemas.