Caracterização de modificações pós-traducionais (MPTs) de peptídeos e proteínas por ETD (Electron Transfer Dissociation)

Resumo

ETD (Electron Transfer Dissociation) é uma nova técnica muito apropriada para a análise de seqüências de peptídeos e proteínas. É particularmente adequado para a identificação de modificações pós-traducionais (MPTs) como fosforilação ou glicosilação e peptídeos altamente básicos. A fragmentação por CID (Collision-induced Dissociation) tipicamente produz espectros com limitação na eficiência de fragmentação do esqueleto peptídico. Porém, quando estes peptídeos são fragmentados por ETD, a fragmentação do esqueleto produz uma série de íons com grandes informações da seqüência dos peptídeos. Assim, as MPTs lábeis permanecem intactas e o sítio de modificação pode ser determinado.Estes exemplos ilustram a utilização da técnica de fragmentação por ETD como uma ferramenta vantajosa na pesquisa proteômica. ETD leva a uma rápida identificação de peptídeos os quais permaneciam resistentes as técnicas por CID, com o benefício adicional da habilidade em analisar amplamente peptídeos trípticos e não trípticos, permitindo a detecção de múltiplas MPTs.Desse modo, nesse projeto, temos como objetivo utilizar a espectrometria de massa por ETD assim como CID na identificação de MPT. Para isto utilizaremos o equipamento de última geração HCTultra ETD II System (Bruker Daltonik, Bremen, Germany) acoplado em um CapLC (Waters) para as análises de seqüências das possíveis MPTs. Dentre as modificações, iremos analisar fosforilações utilizando métodos já descritos na literatura ou adequar os procedimentos de acordo com as amostras a serem analisadas para a otimização da técnica. Para o preparo das amostras utilizaremos amostras digeridas com duas diferentes proteases (Tripsina e Lys-C) e o enriquecimento de fosfopeptídeos por coluna de afinidade a metais como TiO2. Para a fragmentação realizaremos experimentos tanto com CID quanto ETD para analisarmos as melhores condições de trabalho, assim como de preservação dos sítios de fosforilações. As amostras a serem utilizadas serão peptídeos sintéticos com fosforilações pré-determinadas para padronização da técnica e em seguida, amostras biológicas mais complexas fornecidas pelos pesquisadores da Rede Proteoma do Estado de São Paulo/LNLS/Campinas.Informações sobre as modificações pós traducionais tornou possível interpretar a regulação biológica destes processos sob uma nova visão. Várias modificações protéicas finalmente sintonizam as funções celulares de cada proteína. A combinação com as tecnologias de separação e a espectrometria de massa (MS) torna possível isolar e caracterizar as partes individuais das modificações pós traducionais e promover uma análise sistêmica o que ajuda na elucidação dessas modificações nos vários processos de sinalização e de algumas doenças.