Análise das alterações proteômicas induzidas por TGFβ2 na transição epitélio mesenquimal de células epiteliais de mama

O câncer de mama é um dos principais problemas de saúde pública mundial por ser a neoplasia maligna mais frequente entre as mulheres. Apesar dos avanços científicos no entendimento da doença e dos métodos de diagnóstico por imagem um dos grandes desafios ainda é a resolução da sua alta heterogeneidade clínica e molecular. O câncer de mama é causado por diversas alterações genéticas e epigenéticas, como mutações nos genes BRCA-1 e BRCA-2 que são consideradas as mais frequentes. E ainda mutações nos genes TP53, PTEN, ATM, CDH1, CHEK2 e STK11 (LKB1). Além destas mutações, a autossuficiência das células neoplásicas em fatores de crescimento permite que o tumor evolua para estágios mais avançados e desenvolva o processo metastático. Os fatores de crescimento, como o TGFβ, são indutores do processo denominado Transição Epitelial-Mesenquimal (EMT), onde células epiteliais normais, durante a embriogênese, ou células malignas, durante a progressão tumoral e metástase, perdem seus contatos intracelulares e adquirem caráter migratório. A EMT induzida por TGFβ é considerada um dos mecanismos de progressão tumoral e metástase em adenocarcinomas. Assim, neste estudo, a linhagem não tumoral MCF-10A derivada de epitélio mamário foi induzida à EMT com TGFβ2 a fim de provocar alterações moleculares para representar um modelo controlado de metástase. A avaliação da indução da EMT foi feita através de técnicas de qRT-PCR, Western Blotting, MRM (Monitoramento de reações múltiplas) e ensaio de migração celular (Wound-healing). Foram utilizadas técnicas de análise proteômica quantitativa baseada em marcação metabólica com isótopos de aminoácidos em cultura celular (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC) combinada com cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) para caracterizar as alterações morfológicas ocorridas durante a EMT de células MCF-10A. Extratos celulares foram submetidos ao fracionamento subcelular por centrifugação diferencial seguido de fracionamento de proteínas por SDS-PAGE, a fim de reduzir a complexidade das amostras. Ao todo foram geradas 24 frações, correspondendo a duas comparações principais das células MCF-10A induzidas a EMT pelo tratamento com TGFβ: alterações de proteínas citoplasmáticas e de proteínas nucleares. Os dados proteômicos foram coletados em sistema LC-MS/MS identificando ao todo 2603 proteínas, das quais 18% foram exclusivas das frações citoplasmáticas e 24% das nucleares, indicando a importância do fracionamento subcelular para aumentar a cobertura do proteoma. Desse total, apenas 169 proteínas sofreram alteração de expressão após o tratamento com TGFβ2. As 80 proteínas que mais se alteraram foram selecionadas para serem estudadas com mais detalhes. A análise de ontologia quanto à função molecular mostrou que as proteínas que tiveram a expressão aumentada (up reguladas) após a indução da EMT estão relacionadas à ligação a outras biomoléculas, enquanto que as proteínas com expressão reduzida (down reguladas) exercem atividade catalítica. A análise das redes de interações entre as proteínas alteradas demonstrou que existe relação com processos de splicing e biogênese de ribossomos, regulação da síntese proteica, transporte vesicular e divisão celular. Assim, neste estudo foram identificadas proteínas potencialmente importantes para o processo de progressão e metástase no câncer e que, após validação detalhada, podem servir como alvos para a inibição da metástase e/ou diagnóstico da doença metastática. (AU)