Caracterizacao biologica e bioquimica de mcms durante o ciclo de trypanosoma cruzi.

Resumo

O objetivo de nosso laboratório é investigar a replicação de tripanosomas. Este processo inicia-se na transição mitose/G1 quando um hetero-hexâmero denominado ORC 1-6 (Origin Recognition Complex) se liga a seqüências de DNA, denominadas origens de replicação, e recruta outras duas proteínas Cdc6 e Cdt1. Com a chegada destas é possível que outro hetero-hexâmero, MCM 2-7, com atividade de helicase, junte-se a estes formando o complexo de pré-replicação (CPR). Diferente do demais eucariotos, Trypanosoma cruzi não possui ORC 1-6, Cdc6 e Cdt1, mas apenas uma molécula semelhante à Ord e Cdc6 (denominada por nós Orc/Cdc6) e o complexo MCM2-7. Assim, o primeiro objetivo deste projeto é investigar se o CPR de T. cruzi é formado apenas por Orc/Cdc6 e MCM2-7 ou se existem outras moléculas participando desta interação. Para tanto, pretendemos avaliar se (i) MCMs interagem diretamente com Orc/Cdc6 através de ensaio de1 "pull down" e (ii) quais moléculas são capazes de interagir com Orc/Cdc6 através da purificação do extrato de parasitas em colunas de afinidade. Para garantir que as moléculas de DNA sejam replicadas apenas uma vez a cada ciclo celular, o complexo de pré-replicação é inativado pelas ciclinas-CDKs no momento que a célula entra na fase S do ciclo celular. O controle deste processo em eucariontes se dá principalmente através de fosforizações das moléculas que fazem parte do CPR por CDKs que podem resultar em degradação, exportação para o citoplasma ou diminuição da afinidade das proteínas pela cromatina. No T. cruzi este controle da replicação não parece envolver Orc/Cdc6, já que esta permanece ligada ao DNA durante todo o ciclo e não apresenta sítio consenso para fosforização por CDK. Assim, pretendemos também avaliar se as MCMs estão envolvidas no controle da replicação, seja através do controle da expressão, da localização ou da interação com DNA nas diferentes fases do ciclo celular. (AU)